【新要闻】1.2.2 V(D)J重组的发生机制
2023-05-01 21:58:09 来源: 哔哩哔哩


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V(D)J重组可分为两个过程,即DNA剪切和DNA修复。

DNA剪切是由淋巴特异性蛋白重组激活基因(lymphoid-specific proteins recombination-activating gene)RAG1和RAG2,以及普遍表达的DNA结合蛋白--高迁移率族蛋白(high-mobility group box protein)HMGB1或HMGB2介导的位点特异性反应(van Gent et al. 1997)。这些蛋白质可结合目标基因片段侧翼(flank)的重组信号序列(RSS),并在RSS和编码DNA间引入双链断裂(DSB)。随后,通过非同源末端连接(NHEJ)这一DNA修复途径补足DSB(Lieber 2010;Chang et al. 2017)。

补图1.1所示,对于重链编码DNA来说,RSS位于VH片段的3'侧翼、JH的5'侧翼以及DH片段的双侧,类似地,Igκ和Igλ基因座的VL和JL片段的RSS分别在其3'和5'侧翼。RSS是种短的DNA序列,包含12或23个碱基对(±1bp)分隔的保守七聚体(共有序列5'-CACAGTG-3')和九聚体(共有序列5'-ACAAAAACC-3'),即可分为12 RSSs和23 RSSs(Ramsden et al. 1994)。

七聚体中的前三个碱基最为保守,并且对于指导RAGs停留在七聚体和编码片段交界处的正确切割位点所必需;九聚体中,连续的腺嘌呤A序列最为保守,并且已知可引导RAG1结合RSS(Yin et al. 2009)。虽然间隔区(spacer)的序列保守性相对较低,但其长度非常关键,因为12 RSSs和23 RSSs正好相差DNA螺旋的一周,使得两种长度RSS的七聚体和九聚体有机会同时置于相同的相位,从而为互补结合提供结构基础(Ciubotaru et al. 2015)。因此说,只有当某一基因片段的一侧连接12 RSSs,而另一个基因片段的一侧连接23 RSSs时,这对基因才能成对互作并被RAG复合体识别以方便V(D)J重组。这种机制也被称为12/23规则(12/23 rule)。

V(D)J重组酶首先在单个12或23 RSSs上组装,产生一个信号复合体(SC),诱导基因缺口的产生。与对应RSS的联会(synapsis)可导致配对复合体(PC)的形成,进而促使切割反应发生(图1.2)。

一些证据表明PC的形成可由“捕获模型”(capture model)来解释,即一个信号复合体SC捕获配对的RSS以形成PC(Curry et al. 2005; Jones and Gellert 2002; Mundy et al. 2002; Swanson 2002)。然而,捕获模型并未被广泛接受,一些研究转而支持“关联模式”(association mode),即两个预先形成的SC关联形成PC(Shlyakhtenko et al. 2009; Landree et al. 2001)。

图1.2.B所示,生理条件下,DSB仅由PC中的“耦合裂解”(coupled cleavage)途径生成。在“耦合裂解”的两步酯交换反应中,一条DNA链上的游离3'羟基直接攻击另一条链上的磷酸基团(McBlane et al. 1995)。随后,PC中的发夹形成会诱使两个DNA DSBs产生,并生成一对平末端(blunt ends)和两个封闭的发夹状DNA,以上这些过程都有重组酶RAGs参与(Hiom and Gellert 1998)。平末端(信号端)和DNA发夹(编码端)随后都被移交给NHEJ DNA修复途径。修复后,平末端首尾连接形成废弃片段,即DNA删除环。同时,发夹末端经处理和重新连接,产生包含新连接上的抗原受体基因片段的编码接头(coding joint)。

在Igh基因座,首先发生DH和JH片段的重组,随后DH-JH与VH片段重组形成完整的VH-DH-JH外显子;而就Igκ和Igλ基因座而言,VL和JL片段只需一步重组连接。值得注意的是,V、D和J片段的融合并非总是精确固定的,提示重排位点连接潜在的多样性,包括连接区域核苷酸的缺失和所谓的P-或N-核苷酸的插入。具体来说,在V(D)J重组的最后步骤中,若重排基因片段的DNA末端在连接前被核酸外切酶消化,则D到J和/或V到D的连接处会缺失一些核苷酸;若发夹未对称打开,则会诱使单链延伸,从而导致回文插入(P-核苷酸,P表示palindromic回文的);此外,末端双脱氧核苷酸转移酶(TdT)也可以在最终连接之前将“非模板化”N-核苷酸随机引入DNA链的末端。有意思的是,N-核苷酸插入几乎完全发生在Igh基因座中,原因在于TdT优先在经历重链VDJ重排的pro-B细胞中表达。尽管这种不精确性会导致抗体重链和轻链的CDR3区域的多样性,但是,如果缺失或插入加的核苷酸不是3的倍数(一个密码子),会引起移码突变(破坏原有编码序列的阅读框架)。因此,大约三分之二的V(D)J重排属于无效重排,也就是无功能的。

Ig基因座的重排发生在特定的发育阶段,严格遵循时间优先和限定等位基因的原则。Igh基因座首先重新排列,然后是Igκ和Igλ。小鼠B细胞的12号染色体上完成有效重链VDJ重排后,功能性的VDJ-Cμ基因方才启动转录和翻译,而μ链的表达是Ig基因重排和B细胞发育中的一个关键检查点,可以使得其它12号染色体上等位Igh基因座中的V(D)J重组都彻底阻断。这称为限定等位基因(allelic exclusion),因为只有一条染色体贡献了H链(Schatz and Ji 2011;Vettermann and Schlissel 2010)。同理,正常B细胞发育过程中,只有一个L链基因κ或λ表达。一些例外情况将在后文B细胞中央耐受部分介绍。

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责任编辑: 梅长苏